酵母双杂交原理及步骤

酵母双杂交系统

真核生物转录调控因子具有组件式结构 (modular) 特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域， 其中DNA结合结构域( binding domain， BD)和转录激活结构域( activation domain， AD)是转录激活因子发挥功能所必须的。

BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由.不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使.激活转录的功能。

酵母双杂交实验有哪些注意事项

注意事项

（1）酵母双杂交对照的设定 常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统为例：

阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白。

阴性对照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合。 系统显色对照，pGADT7-Pcl1，该表达质粒转入酵母细胞就能引起-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶的分泌，从而检测显色系统是否有问题。

（2）假阳性现象 多种原因可能造成假阳性结果，常见的有以下三种：

筛到的文库蛋白自身具有转录活性，能够启动报告基因的表达——这种情况需要对筛到的候选蛋白进行自激活验证。

酵母细胞内可能同时含有不止一种文库蛋白，其中的一种文库蛋白可以与诱饵蛋白相互及结合。

这种情况需要对阳性克隆再次划板2~3次，以确保每一个酵母克隆中只含有一种文库蛋白和诱饵蛋白；另外划板的次数也不宜过多，否则会出现蛋白表达质粒丢失的情况。 其他一些不明原因造成的假阳性—这种情况需要将筛到的候选文库质粒和表达诱饵蛋白的质粒重新共转入酵母细胞或者通过酵母杂交的方式重新验证，如有必要可以将pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒的载体对调构建成pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新在酵母细胞中验证，真正的阳性结合在对调以后也能在酵母细胞中做出阳性结果。

（3）常见的问题及参考方案 转化效率过低—尽量使用新鲜的培养基以及新鲜的、且直径大小在2~3 mm左右的酵母克隆，以确保酵母的活力；可将用于转化的质粒在使用前进行乙醇沉淀，以提高质粒的纯度和浓度。

杂交效率偏低—可能由于表达的融合蛋白对酵母细胞有毒性，在某些情况下在液体培养基中生长不好的酵母换到琼脂糖固体培养板上时，会生长得比较好，这种情况可以采用共转化的方法进行试验；或者将单转的酵母克隆分别铺到5块10 mm的培养板上，待克隆长出来以后，刮取所有克隆于5 mL 0.5×YPDA中。重悬后再按照常规杂交操作步骤进行操作。 背景过高—当使用HIS3作为报告基因时，由于HIS3基因具有一定程度的泄漏表达，可能会出现背景过高的情况，这时可以使用适量的HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）以降低背景；或者再增加一种更加严格的报告基因的筛选如Ade。

诱饵蛋白具有自激活现象——可以采用克隆突变的方法将产生自激活一段氨基酸序列敲除或突变，但这种方法可能会破坏两蛋白之间的相互作用。

酵母双杂交技术原理

酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生物转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

中文名

酵母双杂交系统原理

类型

系统原理

如

GAL4

英文

DNA-activating domain

快速

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优点应用

二类载体

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。

优点

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。

最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:

〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。

〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。

〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。

一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。

激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。

应用

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：

①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。

②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。

③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。

④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。 同时， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

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